研究報告

沉香樹果實之果筴萃取物成分分析及其細胞毒性試驗

委託單位:生曜生技股份有限公司

研究單位:弘光科技大學生物科技系所

研究計畫主持人:喬長誠

國際間各學術單位、特別研究「沉香」之藥用價值、發表之醫療期刊學術論文報告

沉香樹果實之果筴萃取物成分分析及其細胞毒性試驗

王雨辰、張惠華、張婉琳、林盈蓁、蔡嘉婷、林淑蓉、喬長誠

弘光科技大學生物科技系

摘要

沉香乃沉香樹(Aquilaria sinensis)的樹幹損傷後,經真感染形成之黑棕色樹脂層的心材,在傳統之藥方被作為鎮靜、止痛以及消炎之功用。雖然已有報告分析其葉、樹幹及樹脂之成分,至目前為止,有關果莢成分仍少有文獻報導,本研究以水及酒精萃取果莢成分,進行一般成分分析,以及總酚類(total polyphenols)、總類黄酮(total flavonoids)及三帖類(crude triterpenoids)成分之分析,建立本土栽種生產之沉香果莢之基本成分資料。結果顯示,除水分外,水萃取可獲得較多之醣類成分(17.22%),酒精萃取物則以脂質(27.17%)含量较多。其次在水萃取物與酒精萃取物中,其總酚類(50.46v.s.80.82mg/g)、總類黄酮(167.96v.s.137.41mg/g)及三帖類舍量(0v.s.134.83mg/g),顯示以酒精可萃取较多之總酚類與三帖類含量。由細胞毒性試驗分析,結果顯示對肝腫瘤細胞株之抑制能力,在水萃取物及酒精萃取物其IC50濃度分別在Hep3B(0.49v.s.0.23mg/ml)與HepG2(0.68v.s.0.24mg/ml),且此作用呈現劑量-效應關係,顯示酒精萃取物雖具較佳之抑制能力,然水萃取物亦具相當之效果。本研究結果推測,雖然酒精萃取物具有較佳之抑制癌细胞效果,且含有較多之三帖類含量,比較具有開發成植物藥新藥之潛力,然水萃取物亦有不錯之抑癌效果,值得進一步研究其在生物活性中可能之功效。

關鍵詞:沉香、果莢、萃取、總酚類、總類黃酮、三帖類(crude triterpenoids)、肝癌細胞株、抑制率

實驗架構

實驗設備

加熱攪拌器(Stirrer/Hot plate PC-420 Corning,USA.

超音波機(DC200H)Delta

水浴槽(WB212-B2)Kansin Instrument Co.,LTD

酸鹼測量器(S20K)Mettler Toledo, Switzerland

誠壓濃縮機(R-114)Buchi, Switzerland

冷凝器 (Mode 911) Polyscience, UAS

精密天秤(B204-S)Mettle Toledo,Switzerland

無菌操作台(VCM-620)Cherng Huei,Taiwan

二氧化碳培養箱(RCO3000T-5-T)Forma scientific Inc, USA

酵素免疫分析測讀儀 VERSA max

分光光度計(Biomate3)Thermo Spectronic,USA

高壓減菌器(TM-329) Tomin Medical Equipment Co,,LTD

高速離心機(Mode3740)Kubota,Japan

極低温冷凍櫃(SL-1388D)Kendro laboratory products,USA

倒立式顯微鏡 Olympus,Japan

前言

過去沉香之成分分析之對象皆以樹幹或樹脂為主,其中沉香精油已鑑定之倍半帖烯類(sesquiterpenoids)包括sinenofuranal,sinenofuranol,baimuxinic acid dihydrokaranone及bets-agarofuran(Xu et al,1988),沉香樹脂(agarwood)中含三帖類(triterpenoids)

3-0X0-22-hydroxyhopane,以及各種之2-(2-苯乙基)色酮類[2-(2-phenylethy)chromone]化合物(Konishi et al.,2002)。台灣產白木香(沉香木)萃取物之主要化學成分,南部產6年生葉部為Aristophyll-C:木質部者為N-trans-feruloyltyramine而北部產5年生木質部者為芳香族類之對羥基苯甲酸甲酯(methylparaben)(黄,2007)此外,在葉中亦新發現benzophenone glucoside(aquilarinosideA)以及類黄酮 (7-β-D-glucoside of 5-Ο-methylapigenin)(Qi et al.,2009)之存在。沉香葉酒精萃取物被報導具有止痛及抗發炎之效果(Zhou et al.,2008)。至於沉香果莢萃取物是否具抑制腫瘤细胞之生物活性,及其成分组成尚未有文獻報導,本研究以果莢為分析對象,建立土栽種生產之沉香果莢之基本成分資料,並探討其萃取物對肝腫瘤細胞株之抑制能力。

試藥

一、化學試藥

購自美國Sigma-Aldrich公司:3-(4,5-Dimethy1 thiazol-2-y1)-2,5-dipheny tetrazoliuiim bomide(MTT), Gallic acid , Trypan blue 。

購自Fluka公司:Folin-Ciocalteau phenol reagent。

購自美國Merck公司:Sodium hydroxide(NaOH)。

購自美國Riedel-deHan公司: Dimethylsulfoxid (DMSO), Glycerol, Linoleic acid , Sodium nitrite

(NaNO2), Sodium chloride (NaCl) 。

購自日本島久藥品株式會社:Acetic acid,Sodium carbonate(Na2C03)。

購自台灣台糖公司:Ethanol。

二、細胞培養試藥

購自Hyclone公司 : Dulbecco's modified eagle medium (DMEM-H) 。

購自Biological Industries公司:Fetal bovine serum (FBS), L-Glutamine solution (100mM),Penicillin- Streptomycin。

材料與方法

一、溶劑萃取

秤取100g 的沉香果筴(生曜生技股份有限公司提供)添加2L 不同溶劑包括二次去離子水、乙醇,於 25°C下攪拌萃取1小時,以扳式過濾設備收集濾液,並重複草取兩次,以減壓濃縮機及冷凍乾燥換濃縮至乾,再秤取並計算收率後儲藏於-20°C冰箱備用。

二、一般組成成分分析

以AOAC 方法測定果莢中水分、灰分、粗脂肪、粗蛋白及碳水化合物含量。水分為樣品於105°C的烘箱中乾燥至恆重,由重量損失量除以原様品重而得。灰分含量為樣品於550°C灰化爐中灰化後呈灰白色之様品重。粗脂肪則以正已烷萃取而得。粗蛋白則以凱氏定氮法(Kjeldal method)測定·將上述所得之水分、灰分、粗脂肪及粗蛋白含量以一百扣除,所得數據即為碳水化合物含量。

三、總酚類化合物(total phenolics)含量值測定

參考Taga 等人(1984)之方法,秤取萃取物5mg溶於1ml甲醇,取上述溶液0.1ml添加2ml2%NazCO3混合靜置2分鐘後加入0.1ml50%Folin-Ciocalteau試劑,靜置30分鐘後,於波長750m測吸光值以gallic acid作標準曲線,每克萃取物中總酚含量gallic acid equivalent 毫克數表示。

四、總類黃酮(total flavonoids)含量測

考Zhishen 等人(1999)之方法,250Ml 之5mg/m1 樣品,加入1.25mlddH20與75μl之5%(w/v)NaNO2,均與混合,6分鐘後加入150μl之10%(W/V)AlCl3． 6H20,均勻混合,5分鐘後加入0.5ml 1M NaOH,最後加入dd H2O至總體積2.5ml,均勻混合,檢測510nm下吸光值。以quercetin做標準曲線,將様品吸光值代入標準曲線可得相對quercetin濃度,所得濃度(mg/ml)除以sample 濃度(mg/ml)可得每克萃取物乾重之 quercetin equivalen毫克數(mg/ml)。

五、粗三帖(crude triterpenoids)含量之測定

參考 Fan and He (2006)之方法,取1~10mg/ml萃取物,加0.3ml 5%(w/v)vanillin/glacial

acetic acid及1 ml perchloric acid,於60°C加熱45分鐘後,冷卻,最後加5ml glacial acetic acid,均勻混合後,檢測548nm 下吸光值。以 ursolic acid作標準曲線,將樣品吸光值代入標準曲線可得相對 ursolic acid 濃度,所得濃度(mg/ml)除以sample 濃度(mg/ml)則可得每克萃取物乾重之 ursolic acid equivalent 毫克數(mg/g)。

物24小時,加入MTT(最終濃度0.5mg/ml)反應2小時,去除上清液,加入DMSO溶解formazan結晶,以酵未免疫分析測讀儀檢測570nm之吸光值。

結果與討論

一、沉香果美萃取物之一般組成

果莢之水萃取物與酒精萃取物中水分、灰分、粗脂肪、粗蛋白及碳水化合物含量之基本成分分析結果列於表一,其中水萃取物中的水分約估59.08%,灰分約佔11.55%,粗蛋白質約估9.1%,粗脂肪約估3.05%,碳水化合物含量約估17.22%。由此可見水萃取物經減座濃縮及冷凍乾燥後,仍殘留部分水分,推測萃取物中含有結合水之成分,致未能完全乾澡。酒精萃取物亦有類似之水分含量百分比,唯其中所含之脂質成分含量,顯著比水萃取物之含量高。

表一、沉香果莢水及酒精萃取物之一般組成

Table 1. Proximate composition of aqueous and ethanolic extracts of Aquilaria sinensisfruit pod

二、沉香果莢萃取物之萃取率、總酚、總類黃酮與三帖類之含量之含量

不同溶劑對於様品之萃取率,會因其極性之差異造成萃取效果之不同,由表二中顯示以水萃取效果較佳,可能是因樣品中含有較多之水可溶性物質,例如醣類等,使產率較高。至於一般植物中可能存在具生理活性成分之種類,例如總酚、總類黃酮與三帖類等,亦受溶劑極性差異之影響,致有不同之萃取效果,一般而言,三帖類化合物在有機溶劑中較亦萃取。結果中顯示三帖類化合物僅在酒精萃取物中,符合一般萃取之理論。由於三帖類可能賦與其特殊之生理活性,有可能成為開發植物藥物時之探討目標。

三、細胞毒性試驗

由於在台灣地區近年來十大癌症死因排序中,肝癌仍然高居第二位,為探討沉香果莢之水萃取物與酒精萃取物是否具有成為保肝之植物藥,首先以肝癌細胞株作為篩選之對象。實驗結果顯示,不論水萃取物或酒精萃取物對肝癌細胞株 Hep3B(圖一)及HepG2(圖二)皆有明顯之抑制效果,其50%抑制濃度列於表三所示,顯然以酒精萃取物不論肝癌細胞株 Hep3B或HepG2皆比水萃取物之濃度為低,表示以酒精萃取物具有較佳制肝癌細胞株生長之能力。

四、細胞培養

人類肝癌細胞株(HepG2及Hep3B cell line)細胞毒性試驗。

人類肝腫瘤細胞株 HopG2及Hep3B購自新竹食品工業展研究所。所使用的培養液為DMEM+10%FBS+1% PSN+1% non essential amino acids。細胞培養於37°C,含5%CO2之培養箱。

(一)細胞以不同濃度之萃取物處理後之生長曲線

取3X104的Hep3B奧HepG2 細胞置於24well-plate,待細胞貼壁後,吸乾培養液,換取新鮮的培養液,加入不同濃度的萃取物與區分物,繼續培養24及48小時.以 tetrazolium(MTT) assay測定細胞的存活率。活細胞將tetrazolium代謝成藍紫色之結晶,且此結晶可溶於異丙醇,故測563mm 吸光值可得知活細胞的數目。

(二) PBS (phosphate buffer saline)製備

秤取 1.0587gK2HPO4、0.6119gNaH2PO4·H2O、8gNaCl及0.2gKCI以二次水定量至1L,以NaOH 溶液調整pH至7.4後置入血清瓶,經高溫高壓滅菌後保存於4°C冰箱備用。

(三)細胞培養液製備

將DMEM/high glucose粉末及 3.7gNaHCO3完全溶解於870mL二次去離子水中,以HCI溶液調整pH值至7.4後,在無菌操作中以0.22μm的濾膜過濾後分裝,保存於4°C冰箱備用。

添加10%去活化FBS,1%2mM glutamine,1% penicillin-streptomycin

(5000 units/ml penicillin and 5 mg/ml streptomycin)及 1% pyruvate 於 DMEM/high glucose 培養液中,製備成Hep G2 cell line及Hep 3B cell line 培養液。

(四)細胞株之培養

人類肝腫瘤細胞Hep G2 cell line 及人類肝腫瘤細胞Hep 3B cell line培養於含10%去活化FBS、1%2mM glutamine,1% penicillin-streptomycin及 1%pyruvate 之 DMEM/high glucose 培養液中,於37°C,5%CO2培養箱中,利用相位差微鏡觀察細胞,待細胞生長約90%即進行繼代培養,繼代時先用PBS清洗2次,將細胞於培養皿中打散,最後回種於新的培養皿中。每個培養皿注入約6ml的細胞培養液,細胞培養液約一至兩天更換一次。

(五)細胞存活率測定

參考Mosmann等人(1983)之方法進行。取細胞濃度3x105 cell/well Hep G2 cell line

及Hep 3B cell line 培養在24孔盤24小時後,加入不同濃度沉香果筴水萃取物以及乙醇萃取。

表二、沉香果莢水及酒精萃取物之萃取率、總酚、總類黄酮與三帖類之含量

Table 2. Yield, total phenolics, total flavonoids and triterpenoids of aqueous and ethanolic extracts of Aquilaria sinensis fruit pod

*Results are expressed as mg per gram of dry weight and are means of three replicates土S.D.ND: not detected.

3B MTT ASSAY

圖一、沉香果莢水萃取物及酒精萃取物對肝癌胞Hep3B存活率之影響。

Figure 1. Effect of various aqueous and ethanolic extracts concentrations of Aquilaria sinensis fruit pod on the Cell viability of Hep3B cell lines. Results are means of three replicates ±S.D

參考文獻:

黃顯堂。台灣產白木香萃取物之主要化學成分研究2007立嘉義大學農學研究所碩士論文。

Fan, J. P., He, C. H. 2006. Simultaneous quantification of three major bioactive triterpene acids in the leaves of Diospyros kaki by high-performance liquid chromatography method. Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis 41:950-956.

Konishi, T., Konoshima, T., Shimada, Y., Kiyosawa, S. 2002. Six new2-(2-phenylethy1)chromones from agarwood. Chem. Pharm. Bull. 50(3):419-422.

Qi, J. Lu, J. J., Liu J. H., Yu, B. Y. 2009. Flavonoid and a rare benzophenone glycoside from the leaves of Aquilaria sinensis. Chem. Pharm. Bull. 57(2):134-137.

Taga, M.S., Miller, E.E., Part, D.E. 1984. Chin seeds as a source of natural lipid antioxidants. J. Am. Oil. Chem. Soc. 61: 928-931.

Xu, J. F., Zhu, L. F., Lu, B. Y., Liu, C. T. 1988. Study on the chemical constituents of essential oil of Aquilaria sinensis (Lour.) Gilg. Acta Botanica Sinica 30(6):635-638 (in Chinese).

Zhishen, J., Mengcheng, T., Jianming, W. 1999. The determination of flavonoid contents in mulberry and their scavenging effects on superoxide radicals. Food Chem. 64 : 555-559.

Zhou,M.,Wang, H., Kuo, J., Yu, B. 2008. Antinociceptive and anti-inflammatory activities of Aquilaria sinensis (Lour.) Gilg. leaves extract. Journal of Ethnopharmacology 117:345-350.